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標準曲線要做幾個點合適？

時間：2020-04-14瀏覽量：
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標準曲線的制作依據(jù)？


GB/T22554-2010《基于標準樣品的線性校準》中：


（1）標準曲線的濃度范圍應覆蓋正常操作條件下的被測量范圍；

（2）標準樣品的組分盡量與被測樣品組分一致；

（3）標準樣品的濃度值應等距離的分布在被測量范圍；

（4）標準樣品的個數(shù)至少應有3個濃度；

（5）每個標準點至少重復2次，這個重復是指從稀釋開始；

如果國家標準有相應的濃度系列推薦，盡量按國家標準。工作中我們經(jīng)常采用線性校準，因為線性方程最為簡潔。

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標曲要做幾個點？


標準曲線需要幾個數(shù)據(jù)點，是由所檢測組分的濃度范圍、分析儀響應特性、干擾因素、濃度與檢測信號響應類型有關(guān)的。

3個點：對于一些低濃度，特別是微量分析，并且濃度范圍不是很大的，檢測器響應可靠，背景干擾非常小的，則可以選用較少的工作點就行，一般有3個濃度點就足夠了，有些甚至可以只用一個濃度點就行，另一個點直接用坐標原點。

4~6個點：對于平時測量的樣品濃度范圍較寬，并且檢測器響應不完全是一次曲線（直線）的，可以采用二次曲線或分段校正方式，以減少數(shù)據(jù)偏差，這種情況就需要多用幾個數(shù)據(jù)點，如果不分段，數(shù)據(jù)點有4~6個就夠用。

至少兩個點：但如果是分段校正，則每段需要至少兩個數(shù)據(jù)點。而對于一些樣品無濃度范圍規(guī)律的，特別是一些檢測機構(gòu)，如果分析儀的檢測響應可靠，環(huán)境因素影響少的，可以做校正曲線。若是環(huán)境因素影響大的，則不必做校正曲線，而采用標準加入法或標準加入-一次稀釋法反而簡便一些。

實際上，我們一般是做五個點（不包括零濃度）；一般以檢出限的5~10倍為第一個點，以后根據(jù)1倍遞增，最高濃度是最低濃度的10~20倍為宜（理化分析實驗為例）。當然，要根據(jù)儀器的靈敏度來調(diào)整。

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標曲R值是幾個9才合格？


實驗室應按檢測標準（方法）的要求使用標準溶液或標準物質(zhì)建立標準曲線。所用標準溶液或標準物質(zhì)應覆蓋被測樣品的濃度范圍。檢測標準（方法）如無具體的要求，至少使用5個標樣（除空白外）建立線性標準曲線，每個點重復測定1-3次，對于篩選方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不應低于0.98，對于確證方法，相關(guān)系數(shù)不應低于0.99。

其實，大于0.99是判斷是否為線性相關(guān)的一個標準，實際應用中線性大于0.999才是比較理想的。線性在0.99到0.999之間的監(jiān)測結(jié)果只用接近最高濃度一半（中間濃度）的位置才比較準確，如果線性大于0.999的話，在整個線性范圍內(nèi)都會有一個比較滿意的結(jié)果。

如果檢測的線性不好，可以減少標準的覆蓋范圍，將標準的濃度調(diào)整到待測樣品濃度附近，這樣結(jié)果也是非常準確的。例如，樣品的濃度約20ppb，但在0~50ppb范圍建立標準曲線，但線性非常不理想，這時可以將標準范圍調(diào)整到15~25ppb之間，作五個標準。

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標準曲線的檢驗


（1）線性檢驗：
即檢驗校準曲線的精密度。對于以4～6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準曲線，分光光度法一般要求其相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9990，否則應找出原因并加以糾正，重新繪制合格的校準曲線。

（2）截距檢驗：
即檢驗校準曲線的準確度，在線性檢驗合格的基礎(chǔ)上，對其進行線性回歸，得出回歸方程y=a+bx，然后將所得截距a與0作t檢驗，當取95%置信水平，經(jīng)檢驗無顯著性差異時，a可做0處理，方程簡化為y=bx，移項得x=y/b。在線性范圍內(nèi)，可代替查閱校準曲線，直接將樣品測量信號值經(jīng)空白校正后，計算出試樣濃度。

當a與0有顯著性差異時，表示校準曲線的回歸方程計算結(jié)果準確度不高，應找出原因予以校正后，重新繪制校準曲線并經(jīng)線性檢驗合格。在計算回歸方程，經(jīng)截距檢驗合格后投入使用。

回歸方程如不經(jīng)上述檢驗和處理，就直接投入使用，必將給測定結(jié)果引入差值相當于解決a的系統(tǒng)誤差。

（3）斜率檢驗：
即檢驗分析方法的靈敏度，方法靈敏度是隨實驗條件的變化而改變的。在完全相同的分析條件下，僅由于操作中的隨機誤差導致的斜率變化不應超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%，而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等等。

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標準曲線有效期的規(guī)定？


（1）標準曲線屬于實驗室質(zhì)量控制的范圍，按照《實驗室資質(zhì)認定評審準則》中結(jié)果控制的要求：定期使用有證標準物質(zhì)（參考物質(zhì)）進行監(jiān)控和/或使用次級標準物質(zhì)（參考物質(zhì)）開展內(nèi)部質(zhì)量控制。

（2）準則中并未對“定期”進行規(guī)定，所以如果“定期”，就根據(jù)實驗室的實際情況來定了。

（3）既然準則上沒說明，那根據(jù)一般的分析教材，當實驗條件（包括藥劑、人員、儀器等）發(fā)生變化時，最好重新制作標準曲線。一般來說儀器如果長期使用，并經(jīng)過檢定，是處于穩(wěn)定狀態(tài)，而人員藥劑的變化往往會較大。如果說每次換個人操作都要換曲線，那工作量就太大了。

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每次開機都必須做標準曲線？


從藥品檢測的要求來說，因為：

1、每天所配的流動相都會有所不同，導致出峰的時間都會有一定的差異，峰面積相應都有所差異。

2、檢測器光能也在不斷的衰弱，因此其每天的相應值也有所不同，其峰面積也有差異。

基于以上原因，原則上應該是每天都要進行標準曲線校正的。

標準曲線不要每次都做，但是每次必須進標準品樣品；因為每次你的流動相和原來的不可能完全一樣，同時儀器的狀態(tài)也在變化，所以不同批次間的保留時間是不一致的，所以你必須用隨行標準品來定位與定量。

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校準曲線能不能長期使用？


每批樣品應測定一個校準曲線中間點濃度的標準液，其測定濃度與校準曲線標準點的濃度相對誤差不得超過規(guī)定范圍，如果超過規(guī)定相對誤差，需重新繪制校準曲線。

也可以這樣說，不同的分析項目，不同的分析方法，校準曲線斜率的穩(wěn)定性不同。如校準曲線的斜率較為穩(wěn)定，則在樣品分析時，可只測定兩個標準點，當此兩個標準點與原曲線相應點的相對偏差均小于5%時，可使用原校準曲線。因此，樣品分析前，需根據(jù)斜率的穩(wěn)定性來確定是否需同時制作校準曲線。

我們一般的做法是，根據(jù)檢測的頻率來做，如果該項目天天都要檢測，并且檢測量較多時，要求至少每周做一次曲線。如果檢測量上，一個月都沒有幾單的話，就一個月做一次曲線。當然，儀器如果出現(xiàn)故障并大修后回來的，經(jīng)過檢定后，需要重新做曲線。


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標準曲線是否必須過原點？


標準曲線不一定非要過原點，只要線性好就可以了。因為做空白的話基本上不會過原點。過原點是強制過的，實際曲線可能不過，就會造成誤差。不過原點是因為有系統(tǒng)誤差。

針對是否過原點(0，0)問題，可以從原點(0，0)代表的意義來考慮：
即所測組分濃度為零的時候，信號響應值（液相色譜也就是峰高或者峰面積）是否也為零。通常來說色譜分析是屬于這種情況的，因而可以把（0，0）點作為一個濃度水平計入標準曲線（甚至不需要真的去配一個濃度為零的標準溶液來進樣），這也是單點法定量的一個依據(jù)；而類似的情況在光譜法測定時就講不通了，濃度為零的標準溶液（本底）響應信號（吸光度）往往不是零，這個時候標準曲線就不一定過原點了。

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標準曲線的線性范圍？


線性范圍這個大家都比較清楚，主要從相關(guān)系數(shù)r看，一般要求r大于等于三個九。之前做實驗有時候濃度高時，線性不好，高濃度點不在標準曲線上，而是在標準曲線的下面，而且離擬合的標準曲線比較遠。遇到這種情況，標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)就很差，有時候才一個九，最后我終于想明白了，如果自己用手動擬合的話，用平滑的曲線去連接所有點的話，你就會發(fā)現(xiàn)，如果在線性范圍內(nèi)，連接起來就是直線，如果超出了線性范圍，連接起來就是一條彎曲的曲線。

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相關(guān)系數(shù)的有效數(shù)字？


GB5750.3-2006 8.2.7項有如下規(guī)定：校準曲線相關(guān)系數(shù)只舍不入，保留到小數(shù)點后出現(xiàn)非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小數(shù)點后都是9時，最多保留小數(shù)點后4位。

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Y=bX和二次曲線的選用？


標準曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計檢驗，且要做統(tǒng)計完備的線性檢驗和失擬檢驗，然后再做a與0的差別檢驗，如果a與0的統(tǒng)計學上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗和失擬檢驗，如果線性檢驗合格（P<0.05）且失擬檢驗合格（p>0.05）此時你就可以采用Y=bX。

二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗和失擬檢驗合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計學上參數(shù)最少的統(tǒng)計簡潔性原則。

標準曲線法有一定的優(yōu)勢，也有一定的缺陷，它特別適合于大量樣品的分析。但由于每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應性能，柱溫，流動相流速及組成，進樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標準工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標準樣品（或已知準確含量的樣品），而實際樣品的組成卻千差萬別，因此必將給測量帶來一定的誤差。

了解各個分析項目校準曲線斜率的穩(wěn)定性及影響穩(wěn)定性的主要因素，可決定是否能采用帶標點檢驗原校準曲線，省略重新制作校準曲線;從校準曲線斜率的變化，可判斷標準溶液的穩(wěn)定性，從而確定其標定周期;分析低濃度樣品時，應使用高純度的水和試劑，以減少空白值，降低樣品的分析誤差。


來源：墨跡CNAS和CMA

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